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試劑盒產(chǎn)地：比利時(shí)Bio-X
1.     檢測(cè)原理                           8.  工作液的準(zhǔn)備
2.     操作時(shí)間                           9.  樣品前處理
3.     檢測(cè)下限                           10. 酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
4.     回收率                             11. 操作步驟
5.     交叉反應(yīng)率                         12. 結(jié)果計(jì)算
6.     試劑盒的組成                       13. 結(jié)果分析
7．需要設(shè)備及試劑                     14.注意事項(xiàng)
 
簡(jiǎn)介： 
   克倫特羅（Clenbuterol）屬于beta興奮劑，是一種高選擇性的興奮劑和激素，具有水解脂肪、合成代謝和對(duì)非條紋肌肉組織的松弛作用。進(jìn)年來(lái)被一些人非法添加到飼料中以提高脂肪型動(dòng)物的瘦肉率和加速動(dòng)物的生長(zhǎng)。當(dāng)用作生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑時(shí)，其添加量是治療量的5—10倍，常在動(dòng)物體內(nèi)殘留而給消費(fèi)者帶來(lái)危害。
通常，HPLC或GC-MS是克倫特羅殘留檢測(cè)的確證方法，但是其前處理步驟費(fèi)用昂貴，而ELISA快速檢測(cè)試劑盒因成本低、操作簡(jiǎn)便、速度快、一次檢測(cè)樣本量大、儀器化低，現(xiàn)已成為常規(guī)的篩選方法。
1.檢測(cè)原理：
測(cè)定的基礎(chǔ)是抗原抗體反應(yīng)。微孔板上包被有針對(duì)兔IgG（Clenbuterol抗體）的羊抗體，含有克倫特羅抗原的樣品或標(biāo)準(zhǔn)品與酶標(biāo)記物被加入到小孔中，經(jīng)過(guò)孵育及洗滌步驟后，游離的抗原與抗原酶標(biāo)記物競(jìng)爭(zhēng)抗體結(jié)合位點(diǎn)，沒(méi)有結(jié)合的抗原酶標(biāo)記物在清洗步驟中被除去，將顯色液加入到孔中并且孵育，結(jié)合的酶標(biāo)記物將無(wú)色的發(fā)色劑轉(zhuǎn)化為藍(lán)色的產(chǎn)物。加入反應(yīng)停止液后使顏色由藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色。在450nm處測(cè)量，吸光強(qiáng)度與樣品的克倫特羅濃度成反比。
2.操作時(shí)間：1小時(shí)（30分鐘孵育+30分鐘顯色）
3.檢測(cè)下限：0.1ppb
4.回收率：
尿樣和血清：                 97-110%
飼料：                       95-100%  
肝臟/組織：                  90-97%
牛奶及奶粉                   100%
5.交叉反應(yīng)率：
Clenbuterol （克倫特羅）         100%
Mabuterol（馬普特羅）          100%
Mapenterol（馬噴特羅）         100%
Salbutamal （沙丁胺醇）          8-9%
Terbutalin （特普他林）          7-8%
Simarterol（塞曼特羅）           <0.1%
Isoproterenol（異丙腎上腺素）  <0.1%
Fenoterol（非諾特羅）          <0.1%
6.試劑盒的組成：
1） 96孔酶標(biāo)板：12條╳8孔（包被有抗兔IgG）.
2） 克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)液6瓶：1ml /瓶，為Clenbuterol水溶液:0.1ng/ml，0.3 ng/ml，0.6 ng/ml，1.25 ng/ml，2.5 ng/ml，5 ng/ml.
3）酶聯(lián)結(jié)合物Conjugate peroxidase：                     6ml    黃蓋
4） 抗Clenbuterol抗體溶液：Anti-clenbuterol antibody     11ml   紅蓋
5） 沖洗液（需10倍稀釋）Wash buffer：                    50ml   塑料瓶
6） 檸檬酸鹽緩沖液Citrate buffer：                       25ml   藍(lán)蓋
7）底物溶液Chromogen：                                  3 ml   黑蓋
8）樣品稀釋液（需20倍稀釋）Diluent solution:            10ml   綠蓋
9）反應(yīng)終止液Stop solution：                            6ml    白蓋

7.需要設(shè)備及試劑（試劑盒中未提供）
設(shè)備：
1）  均質(zhì)器
2）  振蕩器
3）  微孔酶標(biāo)儀（450nm）
4）  離心機(jī)
5）  20ul，50ul，100ul，200ul微量加樣器
6）  免疫親和柱（每根柱子可以至少可以純化120-150個(gè)樣本，也可以用C18柱純化）。
試劑：
1）  氫氧化鈉
2）  0.01M  HCL
3）  5M鹽酸
4）  蒸餾水
8.工作液的準(zhǔn)備：
1）  洗液：用蒸餾水按（1+9）稀釋
2）  樣品稀釋液：將樣品稀釋液用蒸餾水按（1+19）稀釋（注：在使用前再配）。
3）  底物溶液：用檸檬酸緩沖液（1+9）稀釋（注：檸檬酸緩沖液本試劑盒內(nèi)有提供，稀釋后的溶液避免光線直射）。
注：終止液含硫酸，要小心操作。
9.樣品前處理：
9.1尿液和血清：（稀釋因子1）
尿液和血清不用處理，直接測(cè)定。（如果尿液渾濁，一定要過(guò)濾或離心）
9.2肝臟
9.2.1（簡(jiǎn)便前處理方法）（稀釋因子3）
1）  取1g肝臟樣品，加入2ml0.01M HCL.
2）  均質(zhì)5分鐘.
3）  檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié).
4）  離心15分鐘3500rpm，或者離心5分鐘13000rpm，轉(zhuǎn)移出上清液備用.
9.2.2.（復(fù)雜前處理方法）（稀釋因子1）
1）  帶有低脂肪的肝，肉或組織.
2）  5g粉碎的樣品于25ml 50mM 鹽酸混合，振蕩15分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。
3）  稱6g均質(zhì)物（相當(dāng)于1g肝臟），加入離心瓶中。
4）  10—15℃離心15分鐘4000rpm或更高的轉(zhuǎn)速。
5）  轉(zhuǎn)移出上清液至另一個(gè)離心瓶中，加300ul 1M 氫氧化鈉混合15分鐘。
6）  加入4ml 500mM 磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0，簡(jiǎn)單混合并在4℃保存至少1.5小時(shí)或過(guò)夜
7）  在10-15℃離心15分鐘，4000g或更高轉(zhuǎn)速。
8）  分離全部上清液（應(yīng)該是清亮的），使其升至室溫（20-24℃），然后用C18柱純化（見(jiàn)C18柱純化步驟）。
C18柱純化方法：
所有試劑和樣品處理必須在室溫下（20-24℃）并嚴(yán)格控制過(guò)柱時(shí)的流速。（非常關(guān)鍵）
1）  用3ml100%甲醇洗滌柱子，流速為1滴/秒。
2）  用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。
3）  樣品進(jìn)柱。
4）  用2ml洗滌液洗滌柱子（50mM磷酸二氫鉀緩沖液pH3.0）。
5）  用正壓去除殘留的液體并用空氣或氮?dú)獯?分鐘干燥柱子。
6）  用1ml100%甲醇洗脫樣品，流速為15滴/分鐘。
7）  在50-60℃弱空氣或氮?dú)饬飨?蒸發(fā)溶劑。
8）  用1ml蒸餾水溶解干燥的殘留物，備用分析。
9.3飼料（稀釋因子10）：
1） 用乳缽研碎飼料，稱1g研碎的飼料樣品加入10ml0.01M的鹽酸，充分混合5分鐘。
2） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)
3） 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾）
4） 直接取上清液進(jìn)行檢測(cè)
9.4牛奶和奶粉（稀釋因子50）：
1） 取1g奶粉或1ml牛奶于50ml試管中，加3ml（牛奶加2ml）蒸餾水
2） 加100ul 5M的鹽酸（調(diào)節(jié)PH至3）
3） 升溫至40℃3-5分鐘直至牛奶凝化，離心5分鐘3500rpm
4） 加5M氫氧化鈉100ul，加入46.8ml蒸餾水，用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)pH值為6.5-8之間
5） 離心15分鐘3500rpm，取上清液進(jìn)行檢測(cè)
9.5組織樣品（稀釋因子50）：
1）1g粉碎的樣品于50ml 試管，加50ml 0.01M HCL混合，振蕩5分鐘，以達(dá)到均質(zhì)的目的。
2） 檢查pH值是否在6.5-8之間，否則用氫氧化鈉或鹽酸調(diào)節(jié)
3） 離心5分鐘3500rpm，轉(zhuǎn)移出上清液。（如上清液仍然渾濁可提高轉(zhuǎn)速或用濾紙過(guò)濾）
4） 直接取上清液進(jìn)行檢測(cè)
10.酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：
1） 將所有試劑升至室溫20-25℃，一旦開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，一定要連續(xù)不間斷。
2） 所有標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣為減少操作誤差，同時(shí)做平行實(shí)驗(yàn)。
3）檢測(cè)樣品建議做平行實(shí)驗(yàn)（可以減少實(shí)驗(yàn)過(guò)程中因操作失誤而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果）。
11.操作步驟：（孵育時(shí)間30分鐘）
1） 按照所要進(jìn)行測(cè)驗(yàn)的微孔板條，從酶標(biāo)板中取出所需的微孔板條并插入框架內(nèi)。
2） 吸取50ul的蒸餾水作為0標(biāo)樣。
3） 吸取50ul標(biāo)準(zhǔn)液和待測(cè)樣品入各自的微孔內(nèi)。
4） 每孔內(nèi)加入50ul酶聯(lián)結(jié)合物，然后再加入100ul 克倫特羅抗體溶液（該反應(yīng)速度快，建議使用多道移液器）。
5） 輕輕敲擊微孔板四周，室溫20-25℃避光孵育30分鐘。
6） 傾空微孔板，用250ul沖洗液重復(fù)洗板5次，zui后，用力在吸水紙上將殘余液滴拍干（洗板時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)清洗液注滿微孔，翻轉(zhuǎn)微孔板傾空，盡量擠壓微孔板，以防微孔板從框架上脫落）。
7） 顯色：每孔加200 ul顯色液，室溫20-25℃避光孵育30分鐘（顯色液用1體積底物溶液+9體積檸檬酸緩沖液） 8） 孵育結(jié)束時(shí)，每孔加50ul反應(yīng)終止液，充分混合，在450nm下讀數(shù)。
12.結(jié)果計(jì)算：
1） 樣品中未知的Clenbuterol通過(guò)曲線定量計(jì)算
2） 將得到的樣品吸光度值減去所有空白值的平均值，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)液吸光值和樣品吸光度值以及zui大吸光度值
3） 用樣品或標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值（B）除以zui大吸光度值（B0）再乘以100，zui大吸光度值接近于100%的吸光度值百分率：

根據(jù)B/B₀的值做出每一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)樣品的半對(duì)數(shù)曲線，相對(duì)應(yīng)每一個(gè)樣品的濃度就可從曲線上讀出。
13.結(jié)果分析：
由于樣品在反應(yīng)中經(jīng)過(guò)了預(yù)先稀釋，因此根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線所得出的待測(cè)樣濃度一定要再乘以其稀釋因子才能得出其在樣品中的正確含量。（尿液和血清的稀釋因子是1，肝臟的稀釋因子是3，飼料的稀釋因子是10，組織的稀釋因子是50，牛奶和奶粉的稀釋因子是50）
14.注意事項(xiàng)：
1）  溫度低于20℃或試劑及標(biāo)品沒(méi)有回到室溫（20-25℃）會(huì)導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的值偏低。
2）  洗板過(guò)程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會(huì)出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象，所以洗板排干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3）  標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和顯色液對(duì)光敏感，避免直接暴露在光線下。
4）  混合要均勻，洗板要*（包括加樣品和標(biāo)準(zhǔn)液的時(shí)候都必需充分混合均勻）。
5）  反應(yīng)停止液為強(qiáng)酸性物質(zhì)，避免接觸皮膚。
6）  不要使用過(guò)了有效期的試劑盒，也不要稀釋或攙雜使用不同生產(chǎn)廠家的試劑盒這樣回引起靈敏度降低。
試劑盒的儲(chǔ)存條件是2-8℃，不要冷凍。