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瓊脂糖凝膠電泳是用瓊脂或瓊脂糖作支持介質(zhì)的一種電泳方法。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔徑較大的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。

01

電泳方法

一般的核酸檢測只需要瓊脂糖凝膠電泳就可以；

如果需要分辨率高的電泳，特別是只有幾個bp的差別應(yīng)該選擇聚丙烯酰胺凝膠電泳；

用普通電泳不合適的巨大DNA鏈應(yīng)該使用脈沖凝膠電泳。

注意巨大的DNA鏈用普通電泳可能跑不出膠孔導(dǎo)致缺帶。

02

凝膠濃度

對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5～2%之間，低濃度的用來進行大片段核酸的電泳，高濃度的用來進行小片段分析。

低濃度膠易碎，小心操作和使用質(zhì)量好的瓊脂糖是解決辦法。

注意高濃度的膠可能使分子大小相近的DNA帶不易分辨，造成條帶缺失現(xiàn)象。

03

緩沖液

常用的緩沖液有TAE和TBE，而TBE比TAE有著更好的緩沖能力。

電泳時使用新制的緩沖液可以明顯提高電泳效果。

注意電泳緩沖液多次使用后，離子強度降低，pH值上升，緩沖性能下降，可能使DNA電泳產(chǎn)生條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

04

電壓和溫度

電泳時電場強度不應(yīng)該超過20V/cm，電泳溫度應(yīng)該低于30℃，對于巨大的DNA電泳，溫度應(yīng)該低于15℃。

注意如果電泳時電壓和溫度過高，可能導(dǎo)致出現(xiàn)條帶模糊和不規(guī)則的DNA帶遷移的現(xiàn)象。

特別是電壓太大可能導(dǎo)致小片段跑出膠而出現(xiàn)缺帶現(xiàn)象。

05

DNA樣品的純度和狀態(tài)

注意樣品中含鹽量太高和含雜質(zhì)蛋白均可以產(chǎn)生條帶模糊和條帶缺失的現(xiàn)象。

乙醇沉淀可以去除多余的鹽，用酚可以去除蛋白。

注意變性的DNA樣品可能導(dǎo)致條帶模糊和缺失，也可能出現(xiàn)不規(guī)則的DNA條帶遷移。

在上樣前不要對DNA樣品加熱，用20mm NaCl緩沖液稀釋可以防止DNA變性。

06

DNA的上樣

正確的DNA上樣量是條帶清晰的保證。

注意太多的DNA上樣量可能導(dǎo)致DNA帶型模糊，而太小的DNA上樣量則導(dǎo)致帶信號弱甚至缺失。

07

Marker的選擇

DNA電泳一定要使用DNA Marker或已知大小的正對照DNA來估計DNA片段大小。

Marker應(yīng)該選擇在目標(biāo)片段大小附近ladder較密的，這樣對目標(biāo)片段大小的估計才比較準(zhǔn)確。

需要注意的是Marker的電泳同樣也要符合DNA電泳的操作標(biāo)準(zhǔn)。

如果選擇λDNA/HindIII或者λDNA/EcoRI的酶切Marker，需要預(yù)先65℃加熱5min，冰上冷卻后使用。

從而避免HindIII或EcoRI酶切造成的粘性接頭導(dǎo)致的片段連接不規(guī)則或條帶信號弱等現(xiàn)象。

08

凝膠的染色和觀察

實驗室常用的核酸染色劑是溴化乙錠（EB），染色效果好，操作方便，但是穩(wěn)定性差，具有毒性。

注意觀察凝膠時應(yīng)根據(jù)染料不同使用合適的光源和激發(fā)波長，如果激發(fā)波長不對，條帶則不易觀察，出現(xiàn)條帶模糊的現(xiàn)象。