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酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)

1.原理：免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理，對待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析（下稱ELISA）是免疫分析的一種，分三個(gè)部分組成：免疫識別，信號輸出和數(shù)據(jù)處理。

2.步驟：免疫識別是在聚苯乙烯制成的96孔板上包被抗體，而后利用抗體識別待測的抗原（通常是疾病的蛋白質(zhì)生物標(biāo)記物，病毒，細(xì)菌等等，從復(fù)雜待測液中將抗原吸附到96孔板表面。接著用帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）、熒光或放射性標(biāo)記的抗體通過直接或者間接的方式輸出識別信號。最后利用信號強(qiáng)度，標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度梯度等信息計(jì)算得出待測樣中目標(biāo)抗原的濃度。

3.分類：根據(jù)免疫識別和信號輸出方式的不同，ELISA可以分為雙抗體夾心法、直接免疫競爭法和非直接免疫競爭法等等。其中雙抗體夾心法在商業(yè)應(yīng)用上最常見。

雙抗體夾心法：

①：抗體包被 在96孔板上包被抗體。由于酶標(biāo)板是由聚苯乙烯制成，其含有的苯環(huán)與抗體的氨基酸殘基具有類似π-π堆積作用的引力，結(jié)合靜電和疏水作用，可以將抗體吸附于其表面。然后，將未吸附的抗體用緩沖液清洗后，加入含有明膠或牛血清蛋白（Bovine Serum Albumin, BSA）的封閉液以封閉酶標(biāo)板上未結(jié)合抗體的部分。加入封閉液的目的，是防止其他蛋白因靜電或疏水作用吸附在96孔板上，造成假陽性信號，干擾后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行。

②：免疫識別 在96孔板上包被抗體后，加入待測樣，并在37°C環(huán)境下孵育一段時(shí)間，通常是1-2小時(shí)。此時(shí)酶標(biāo)板上的抗體與待測抗原進(jìn)行特異性識別結(jié)合。此處抗體的質(zhì)量是關(guān)鍵，好的抗體既能特異性高效地結(jié)合抗原又不受待測樣中其他生物大分子、蛋白質(zhì)和無機(jī)鹽等成分的影響。

③：洗板 將未結(jié)合的抗原洗掉，加入該抗原所對應(yīng)的識別抗體并在37°C下繼續(xù)培養(yǎng)1-2小時(shí)，接著將未連接上抗原的抗體洗掉。

④：酶標(biāo)信號輸出 加入帶有辣根過氧化酶（Horseradish Peroxidase, HRP）標(biāo)記的酶標(biāo)二抗，用于和標(biāo)準(zhǔn)抗體結(jié)合。在培養(yǎng)30分鐘后洗掉未連接的二抗，并加入顯色劑顯色。根據(jù)顯色的結(jié)果判斷抗原的濃度。一般認(rèn)為，抗原濃度與顯色后的發(fā)光強(qiáng)度呈正相關(guān)。

免疫競爭法

以抗原競爭抗體為例，在上述免疫夾心法操作步驟的第二步加入待測抗原后，立刻加入酶標(biāo)抗原，使之與待測抗原競爭識別酶標(biāo)板上的抗體。當(dāng)待測抗原濃度越高，能夠連上酶標(biāo)板上抗體的酶標(biāo)抗體就越少，輸出的信號就越少。這樣待測樣濃度與酶顯色信號就呈逆相關(guān)。